เนื้อหา
Polyacrylamide gel electrophoresis หรือ PAGE เป็นเทคนิคที่ใช้สำหรับการแยกโมเลกุลอินทรีย์ในตัวอย่างทางชีวภาพ โมเลกุลที่มีขนาดเล็กและน้ำหนักจะเคลื่อนที่อย่างรวดเร็วมากขึ้นในเจลโพลีอะคริลาไมด์เมื่อมีการใช้กระแสไฟฟ้า มักจะสังเกตเห็นได้ชัดเจนหลังจากที่เจลที่บ่มเสร็จแล้วนั้นอยู่ในจุดเดียว นี่เป็นวิธีการที่ค่อนข้างง่าย อย่างไรก็ตามการไม่มีแถบแบนด์ที่ไม่ชัดเจนหรือไม่ชัดเจนอาจบ่งบอกถึงปัญหาในขั้นตอนหนึ่งหรือหลายวิธี คุณควรปฏิบัติตามแนวทางพื้นฐานเพื่อแก้ปัญหาของวิธีการเจลอิเล็กโทรโฟเรซิสซึ่งผลลัพธ์ไม่เป็นไปตามที่คาดไว้
คำสั่ง
-
เริ่มต้นด้วยขั้นตอนสุดท้ายของเจลอิเล็กโตรโฟเรซิสและทำงานย้อนหลัง สำหรับเจลอิเล็กโทรโฟเรซิสขั้นตอนสุดท้ายคือขั้นตอนการย้อมสีที่ใช้ในการสังเกตแถบตัวอย่าง ควรมีปัญหาเล็กน้อยเกิดขึ้นจริงในระหว่างกระบวนการย้อมสี อย่างไรก็ตามสีย้อมสีควรละลายในบัฟเฟอร์ที่เหมาะสมก่อนที่จะใช้ในการย้อมเจล ตรวจสอบว่าใช้ความเข้มข้นของสีย้อมที่ถูกต้อง
-
ตรวจสอบแหล่งพลังงาน การไม่มีแถบคาดอาจบ่งบอกว่าการกำหนดค่ากระแสหรือแรงดันไฟฟ้าสูงเกินไปและตัวอย่างการทดสอบจะย้ายออกจากเจล การตั้งค่าที่สูงสามารถทำให้ส่วนประกอบตัวอย่างเคลื่อนย้ายผ่านเจลเร็วเกินไปส่งผลให้ความละเอียดต่ำและแถบที่ไม่ชัดเจน ตัวอย่างอาจไม่โยกย้ายผ่านเจลหากการกำหนดค่าแหล่งพลังงานต่ำ ตัวอย่างอาจสะสมอยู่ในบ่อน้ำที่มีการบรรทุกและไม่ย้ายผ่านเจล
-
ตรวจสอบอะคริลาไมด์เหลวที่ใช้ในการแปลงเจล polyacrylamide โดยทั่วไปเปอร์เซ็นต์ของอะคริลาไมด์ที่ใช้ในการแปลงเจลโพลีอะคริลาไมด์จะอยู่ในช่วงตั้งแต่ 5% ถึง 15% ตัวอย่างที่ประกอบด้วยโมเลกุลขนาดใหญ่จะถูกบรรจุลงในเจล 5% เนื่องจากชิ้นส่วนขนาดใหญ่เคลื่อนที่ช้ากว่าในเจลที่มีอะคริลาไมด์สูงกว่า โมเลกุลขนาดเล็กจะถูกบรรจุลงในเจลเปอร์เซ็นต์ที่สูงกว่าเนื่องจากความเข้มข้นของเจลที่ต่ำจะไม่สามารถประมวลผลตัวอย่างที่มีขนาดเล็กลงได้
-
ตรวจสอบรีเอเจนต์ที่ใช้ในการรวมอะคริลาไมด์ เจลโพลีอะคริลาไมด์เกิดขึ้นจากการรวมตัวของพอลิเมอไรเซชันของส่วนผสมของเหลวซึ่งประกอบด้วย bis-acrylamide และ acrylamide แอมโมเนียม persulphate และ TEMED จะถูกเพิ่มเข้าไปในอะคริลาไมด์เพื่อเร่งการเกิดเจล โดยทั่วไปอะคริลาไมด์ควรแสดงสัญญาณการเกิดพอลิเมอไรเซชั่น (การก่อเจล) 15 นาทีหลังจากแอมโมเนียมซัลเฟตและ TEMED การเกิดพอลิเมอไรเซชั่นที่เกิดขึ้นอย่างรวดเร็วนั้นเป็นผลมาจากปริมาณแอมโมเนียมซัลเฟตจำนวนมาก เมื่อไม่เพียงพออาจทำให้พอลิเมอไรเซชันไม่สมบูรณ์หรือไม่สม่ำเสมอ
-
ยืนยันปริมาณตัวอย่างที่โหลด ตัวอย่างที่มีความเข้มข้นสูงสามารถเคลื่อนที่อย่างช้า ๆ ผ่านเจลและลดความละเอียดของแถบสัญญาณได้ ความเข้มข้นของตัวอย่างต่ำอาจไม่สามารถสังเกตได้หลังจากเจลเปื้อน สีย้อมเหล่านี้มีข้อ จำกัด เกี่ยวกับปริมาณตัวอย่างขั้นต่ำที่สามารถมองเห็นได้ซึ่งเป็นผลมาจากความไวของสี
-
ยืนยันคุณภาพของตัวอย่างที่โหลด เกลือและสารปนเปื้อนอื่น ๆ ที่มีอยู่ในตัวอย่างสามารถส่งผลกระทบต่อการเคลื่อนไหวของตัวอย่างตามเจล อิเล็กโทรโฟรีซิสเป็นผลมาจากการส่งกระแสไฟฟ้าผ่านเจลที่มีบัฟเฟอร์กระแสไฟฟ้า ความเข้มข้นสูงของเกลือในตัวอย่างอาจส่งผลต่อการเคลื่อนที่ของกระแสนี้ผ่านเจล เมื่อแยกตัวอย่างชุดอุปกรณ์ทำให้บริสุทธิ์ควรรวมเข้าด้วยกันเพื่อสร้างตัวอย่างที่ค่อนข้างบริสุทธิ์
-
ตรวจสอบวรรณกรรมหรือโปรโตคอลเป็นลายลักษณ์อักษรเพื่อตรวจสอบว่าใช้ "PAGE" ที่ถูกต้องเพื่อดำเนินการทดสอบหรือไม่ เปอร์เซ็นต์ของอะคริลาไมด์ใน "PAGE" มีความเฉพาะกับขนาดของตัวอย่างที่จะทดสอบ วรรณกรรมสามารถให้ข้อมูลเฉพาะเกี่ยวกับการจัดตั้งแหล่งพลังงานและอัตราการย้ายถิ่นของตัวอย่าง
เคล็ดลับ
- แนวทางที่มีให้เป็นเรื่องทั่วไปสำหรับการใช้งานในการวิจัยทางชีววิทยา
- เมื่อทำการแก้ไขขั้นตอนในห้องปฏิบัติการใด ๆ วิธีที่ดีที่สุดคือเริ่มต้นด้วยขั้นตอนสุดท้ายและทำงานย้อนหลังเพื่อกำหนดปัญหา
การเตือน
- เมื่อจัดการอะคริลาไมด์และโพลีอะคริลาไมด์ให้สวมถุงมือ อะคริลาไมด์เป็นรีเอเจนต์ที่เป็นพิษต่อระบบประสาทและสามารถดูดซึมผ่านผิวหนังได้ โพลีอะคริลาไมด์ไม่ได้เป็นสารพิษต่อระบบประสาท แต่มักจะมีอะคริลาไมด์ที่ไม่ได้โพลีเมอไรด์และอาจยังถือว่าเป็นพิษ
สิ่งที่คุณต้องการ
- เกรดของทวิคุณภาพ: แผ่นอะคริลาไมด์หรือแผ่นรูปก่อน
- แผ่นกระจกสองแผ่น
- Bis-ริลาไมด์
- บัฟเฟอร์ TBE (ทริส, กรดบอริก, EDTA)
- แหล่งจ่ายไฟ
- ฝาปิดห้องด้านบน
- ฝาปิดห้องล่าง
- โปรตีนตัวอย่าง DNA
- TEMED
- แอมโมเนียมซัลเฟต
- เจลสำหรับทำสี