เนื้อหา
- การตรวจจับโดยใช้การเปลี่ยนสี
- การใช้เครื่องอ่าน ELISA สำหรับการวัด
- การแข่งขันโดยตรงของ ELISA (cytochrome c)
- ฟักตัวแอนติบอดีปฐมภูมิในหลอด
การทดสอบ ELISA เป็นวิธีการทดสอบอิมมูโนซอร์เบนต์ที่เชื่อมโยงกับเอ็นไซม์ที่ใช้แอนติบอดีหรือแอนติเจนควบคู่กับเอนไซม์เฉพาะเพื่อช่วยกำหนดความเข้มข้นของแอนติบอดีหรือแอนติเจน หากคุณใช้ ELISA และไม่สามารถใช้แอนติบอดีจำเพาะเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ของคุณแนะนำให้ทำการแข่งขัน ELISA เพราะจะใช้แอนติเจนที่ผันไปยังเอนไซม์แทนที่จะเป็นแอนติบอดีและวิธีตรวจจับที่แตกต่างกัน
การตรวจจับโดยใช้การเปลี่ยนสี
โปรโตคอลทั่วไปสำหรับการแข่งขัน ELISA คือการใช้แอนติบอดีปฐมภูมิที่ไม่มีชื่อและบริสุทธิ์ แอนติบอดีจะเคลือบบ่อน้ำของ microtiter และบ่มด้วยมาตรฐานที่ไม่รู้จัก จากนั้นอิมมูโนเจนจะถูกรวมเข้ากับคอนจูเกตแอนติบอดีปฐมภูมิซึ่งจะจับกับบริเวณแอนติบอดี้ที่ยังไม่ได้ครอบครอง จากนั้นจะใช้วัสดุพิมพ์เพื่อสร้างการเปลี่ยนสีเพื่อวัดความเข้มข้นของการจับ
การใช้เครื่องอ่าน ELISA สำหรับการวัด
ใช้แผ่นสไตรีนไมโครสไตรีนและเพิ่มแอนติบอดีปฐมภูมิให้กับแต่ละหลุม เพื่อให้เกิดการจับยึดสูงสุดให้เติมบ่อน้ำด้วยแอนติบอดีหนึ่งไมโครกรัม ฟักจานเป็นเวลาสี่ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง เพิ่มแอนติบอดีจับหลักและล้างหลุมด้วย PBS (เกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์) ฟักจานที่มีบัฟเฟอร์บล็อกเป็นเวลาสองชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง ล้างหลุมอีกครั้งด้วย PBS และเพิ่มมาตรฐาน วางสารละลายแอนติเจนคอนจูเกตในหลุมแล้วฟักไข่อีกครั้งเป็นเวลาสองชั่วโมง ล้างจานอีกครั้งด้วย PBS สี่ครั้ง เพิ่มวัสดุพิมพ์และวัดความหนาแน่นที่ความยาวคลื่นเฉพาะโดยใช้เครื่องอ่าน ELISA
การแข่งขันโดยตรงของ ELISA (cytochrome c)
สำหรับ ELISA ที่แข่งขันโดยตรงต้องทำการวิเคราะห์การเจือจางเซรั่มสำหรับแอนติเจนที่คุณใช้ในการทดลอง แผ่นไมโครเคลือบแล้วเคลือบด้วยไซโตโครมและบ่มในชั่วข้ามคืน ส่วน ELISA ของการทดสอบนั้นจะดำเนินการโดยการเพิ่มการปิดกั้นสารเคมีและแอนติบอดีรอง ผลการดูดซับจะถูกอ่านด้วยเครื่องอ่าน microplate
ฟักตัวแอนติบอดีปฐมภูมิในหลอด
ในขั้นตอนนี้แอนติบอดีปฐมภูมิจะถูกบ่มในหลอดทดลองที่แอนติเจนที่น่าสนใจจับกับมัน จากนั้นตัวอย่างจะถูกเพิ่มลงในหลุมของแผ่นไมโครและทำการบ่ม จากนั้นจะทำการล้างบ่อเพื่อกำจัดสารประกอบแอนติเจนและแอนติบอดีที่ไม่ถูกผูกไว้ออกจากนั้นจึงเพิ่มสารละลายการปิดกั้นเพื่อป้องกันไม่ให้แอนติบอดีตัวที่สองจับกับหลุม แอนติบอดีทุติยภูมิจะถูกอ่านบนเครื่องอ่านเพลทเพื่อให้ได้ผลลัพธ์